體外診斷試劑產(chǎn)品注冊技術審評報告

受理號:CSZ2000253

體外診斷試劑產(chǎn)品注冊技術審評報告

產(chǎn)品中文名稱:六項呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒 (多重熒光 PCR 法)

產(chǎn)品管理類別:第三類
申 請 人 名 稱:圣湘生物科技股份有限公司

國家藥品監(jiān)督管理局
醫(yī)療器械技術審評中心

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目錄

基本信息......................................................................................................3 一、申請人名稱......................................................................................... 3 二、申請人住所......................................................................................... 3 三、生產(chǎn)地址............................................................................................. 3 產(chǎn)品審評摘要............................................................................................. 4 一、產(chǎn)品概述............................................................................................. 4 二、臨床前研究摘要................................................................................. 5 三、臨床評價摘要................................................................................... 11 四、風險分析及說明書提示................................................................... 14 綜合評價意見........................................................................................... 16

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一、申請人名稱

圣湘生物科技股份有限公司

二、申請人住所

長沙高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)麓松路 680 號 三、生產(chǎn)地址 長沙高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)麓松路 680 號

基本信息

一、產(chǎn)品概述

技術審評概述

(一)產(chǎn)品主要組成成分

產(chǎn)品試劑盒由以下組分組成，主要組成成分見表1。 表1 試劑盒主要組成成分

其他內(nèi)容詳見產(chǎn)品說明書

(二)產(chǎn)品預期用途

本試劑盒用于定性檢測人痰液中臨床常見下呼吸道病 原菌，包括肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、莢膜型流感嗜血 桿菌、銅綠假單胞菌、嗜肺軍團菌和金黃色葡萄球菌。

檢測結果可用于呼吸道疑似細菌感染的住院病人或重 癥病人的輔助診斷，檢測結果不直接用于指導抗生素的使用， 臨床診斷應結合病原體培養(yǎng)鑒定。

(三)產(chǎn)品包裝規(guī)格

24人份/盒
(四)產(chǎn)品檢驗原理 本試劑盒是基于Taq酶水解熒光探針產(chǎn)生熒光信號及帶

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熒光產(chǎn)物雜交產(chǎn)生熒光信號的兩種技術原理，針對單色熒光 通道中一個目標靶點的檢測采用熒光探針，另一個目標靶點 的檢測采用熔解曲線的方式，從而實現(xiàn)在單色熒光通道中同 時進行兩個目標靶點的檢測和分析。試劑盒針對待檢測細菌 核酸保守區(qū)設計的特異性引物、特異熒光探針，配以PCR反 應液等組分，在熒光定量PCR儀上，應用多重實時熒光定量 PCR檢測技術，通過熒光信號的變化實現(xiàn)對待測樣本中下呼 吸道病原菌核酸的快速檢測。

PCR檢測體系含有陽性內(nèi)對照(內(nèi)標)，通過檢測待測 樣本中編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)管家基因的DNA 是否正常，進而來監(jiān)測待測樣本的提取過程和PCR擴增過程， 避免假陰性結果。

二、臨床前研究概述

(一)主要原材料

1.主要原材料的選擇

本產(chǎn)品的主要原材料包括:引物、探針、dNTPs、熱啟 動Taq酶、UDG酶、質(zhì)粒。這些原材料均為外購方式獲得。 引物、探針為申請人自行設計后由專業(yè)合成公司合成。申請 人選擇有資質(zhì)的供應商提供的原料，通過功能性試驗，篩選 出最佳原材料和供應商，制定了各主要原材料的質(zhì)量標準并 經(jīng)檢驗合格。

2.企業(yè)參考品和質(zhì)控品設置情況

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企業(yè)參考品采用真實樣本制備而成，包括陽性參考品 (PC1~PC12)、陰性參考品(NC1~NC8)、檢測限參考品 (LC1-LC6)以及精密度參考品(RC1~RC2)。

陽性參考品(PC1~PC12)由經(jīng)過滅活處理后不同濃度 的12份六項呼吸道病原菌陽性樣品組成，其中PC1、PC2肺炎 鏈球菌陽性，其余病原菌陰性;PC3、PC4肺炎克雷伯桿菌陽 性，其余病原菌陰性;PC5、PC6流感嗜血桿菌陽性，其余病 原菌陰性;PC7、PC8金黃色葡萄球菌陽性，其余病原菌陰性; PC9、PC10銅綠假單胞菌陽性，其余病原菌陰性;PC11、PC12 嗜肺軍團菌陽性，其余病原菌陰性。

陰性參考品NC1~NC6為種屬相近的或引起癥狀相似的 病原菌，分別為溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動桿 菌、大腸埃希菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、嗜麥芽窄食單胞菌陽性樣 本，NC7，NC8為正常人痰液樣本。

檢測限參考品LC1~LC6為試劑盒覆蓋的6種陽性病原 菌，其中LC1為肺炎克雷伯桿菌、LC2為肺炎鏈球菌、LC3 為流感嗜血桿菌、LC4金黃色葡萄球菌、LC5為銅綠假單胞 菌、LC6嗜肺軍團菌。

精密度參考品RC1~RC2為試劑盒覆蓋的6種陽性病原菌 混合樣品。

試劑盒包含陽性對照品和陰性對照品各1支，用于檢測 過程的質(zhì)量控制。陽性對照品為添加有內(nèi)標基因和目標病原

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菌基因的混合質(zhì)粒樣本，覆蓋試劑盒可檢出的所有目標病原
菌，陰性對照品為生理鹽水。

  (二)生產(chǎn)工藝及反應體系研究

申請人通過對試劑主要生產(chǎn)工藝的研究，確定了最佳生 產(chǎn)工藝。申請人對樣本中可能存在的抑制因素進行了測試， 以及對樣本核酸提取方法、取樣量、上機用量進行了研究; 同時對引物、探針、Taq酶、UDG酶、dNTPs、Mg離子等的 濃度和體積進行了優(yōu)化;并對反應條件進行優(yōu)化，包括痰液 液化方法選擇、UDG酶處理時間、變性時間、退火和延伸溫 度、循環(huán)數(shù)的選擇以及適用儀器類型的研究，并通過驗證最 終確定了最佳反應體系。

(三)分析性能評估

本產(chǎn)品分析性能評估內(nèi)容主要包括:核酸提取性能、準 確度、精密度、最低檢測限、特異性、包容性、攜帶污染驗 證、競爭性干擾研究等。申請人提交了有效運行的質(zhì)量管理 體系下生產(chǎn)的三批產(chǎn)品，在適用機型SLAN-96P全自動醫(yī)用 PCR分析系統(tǒng)、Life Technologies QuantStudio TM 5熒光PCR 儀上的性能評估資料。

  在核酸提取效率中，比較評估了產(chǎn)品配套使用的核酸提
取試劑盒的提取效果，結果表明配套使用的核酸提取試劑盒
的核酸提取效率滿足產(chǎn)品使用需求。

  在準確度中，申請人采用三批成品試劑盒，檢測企業(yè)陽

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性參考品和陰性參考品，以及臨床樣本與國家參考品。結果 表明陽性符合率和陰性符合率均為100%。

在精密度研究中，申請人采用三批成品試劑盒，對陰性 和兩個不同濃度的3份混合臨床樣本，進行了連續(xù)21天的重 復性檢測，評估了批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間、不同地點、不同 操作者之間的精密度。結果表明:試劑盒批內(nèi)/批間、日內(nèi)/ 日間、不同地點、不同操作者之間均有著很好的檢測重復性， 精密度好。

在最低檢出限研究中，申請人采用三批成品試劑盒，檢 測系列濃度梯度樣本，研究樣本包含目標菌的常見型別，將 達到95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢出限， 并進行最低檢測限驗證。最終確定該產(chǎn)品各靶標最低檢測限 分別為肺炎克雷伯菌900 CFU/mL、肺炎鏈球菌15 CFU/mL、 流感嗜血桿菌625 CFU/mL、銅綠假單胞菌675 CFU/mL、嗜 肺軍團菌340 CFU/mL、金黃色葡萄球菌2875 CFU/mL。

在包容性研究中，申請人采用三批成品試劑盒，對收集 不同地區(qū)的各目標菌的陽性樣本及不同型別病原體進行檢 測。包括肺炎克雷伯菌肺炎亞種、鼻硬結亞種、[KPC]耐藥 型、臭鼻亞種，肺炎鏈球菌1型、6B型、14型、2型、3型， 流感嗜血桿菌A型、B型、C型，銅綠假單胞菌黏液型、非黏 液型，嗜肺軍團菌1型、2型、3型、4型、6型，金黃色葡萄 球菌金黃亞種、MRSA。檢測結果表明，本試劑檢測不同地

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區(qū)收集的肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠
假單胞菌、嗜肺軍團菌、金黃色葡萄球菌及不同型別的病原
體均能正確檢出，說明試劑盒有較好的包容性。

在特異性研究中，申請人采用三批成品試劑盒，進行了 近源菌及不在試劑盒檢測范圍中的呼吸道感染相關病原體 的交叉反應。結果表明:本試劑盒與溶血葡萄球菌、表皮葡 萄球菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、嗜麥 芽窄食單胞菌、糞腸球菌、白色念珠菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、化 膿鏈球菌、滕黃微球菌、馬紅球菌、格氏李斯特菌、瓊氏不 動桿菌、副流感嗜血桿菌、杜莫夫軍團菌、產(chǎn)氣腸桿菌、溶 血嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、唾液鏈球菌、腦膜 炎奈瑟菌、結核分枝桿菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、 黃曲霉菌、土曲霉菌、煙曲霉菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌 無交叉反應。

在干擾性研究中，申請人采用三批成品試劑盒，進行了 在內(nèi)源/外源干擾物質(zhì)研究及競爭性干擾研究，對樣本中可能 含有的干擾物質(zhì)分別進行評價，包括100μg/mL美羅培南、 100μg/mL亞胺培南、100μg/mL頭孢哌酮舒巴坦、100μg/mL 莫西沙星、100μg/mL阿米卡星、100μg/mL利奈唑胺、 100μg/mL萬古霉素、60μg/mL氯化鈉、20%(v/v)無水乙醇、 10μg/mLEDTA、20%(v/v)人全血、20μg/mL純化粘蛋白、10μg/mL血紅素等，結果顯示內(nèi)外源干擾物質(zhì)不會對產(chǎn)品檢

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測結果產(chǎn)生干擾。同時在競爭性干擾研究中，當一種病原體 在最低檢測限濃度附近，其他病原體為高濃度時，各靶標之 間不會產(chǎn)生競爭干擾。故試劑盒檢測結果不受內(nèi)源/外源干擾 物質(zhì)及競爭性干擾影響。

(四)陽性判斷值

申請人對收集的臨床樣本進行檢測，獲得原始的Ct值和 Tm值用于制定各指標的陽性判斷值。對于含有陽性和陰性數(shù) 據(jù)的指標，采用ROC曲線法制定各指標的陽性判斷值。并進 行了陽性判斷值的驗證，根據(jù)驗證結果最終確定了試劑盒的 陽性判斷值見表2。

表2陽性判斷值

(五)穩(wěn)定性研究

  申請人對本產(chǎn)品的實時穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、反復凍融
穩(wěn)定性以及樣本穩(wěn)定性進行了研究，確定了在各種條件下本
產(chǎn)品及樣本的有效保存時間。

實時穩(wěn)定性:試劑盒儲存于-20°C±5°C。分別于不同時 — 10 —

間點領取完整包裝的試劑盒，對其外觀、陰陽性符合率、最 低檢測限和精密度進行考察。結果表明試劑盒在-20°C±5°C 條件下，本試劑盒有效期為12個月。

開瓶穩(wěn)定性及反復凍融穩(wěn)定性:申請人對成品試劑盒按 照規(guī)定儲存溫度進行儲存，試劑盒凍結后再取出置于室溫解 凍，如此反復凍融數(shù)次。將凍融后的產(chǎn)品在不同時間點進行 外觀、陰陽性符合率、最低檢測限、精密度的考察。結果表 明，試劑開封后不影響試劑盒有效期，使用過程中盡量避免 反復凍融，凍融次數(shù)不超過3次。

申請人對樣本和核酸保存穩(wěn)定性及凍融次數(shù)進行了研 究。結果表明:適用于本試劑的樣本和核酸在2°C~8°C保存 不得超過72小時，-20°C保存不得超過36個月，-70°C保存不 得超過36個月;樣本盡量避免反復凍融，凍融次數(shù)不超過4 次。

三、臨床評價概述

  申請人在湖南省人民醫(yī)院、湖南省兒童醫(yī)院、江西省兒
童醫(yī)院、武漢市傳染病醫(yī)院共四家臨床機構完成了臨床試驗。

  臨床試驗主要包括三部分內(nèi)容:

第一部分，采用試驗用體外診斷試劑與病原體核酸測序 方法進行比對。共計入組1548例具有下呼吸道癥狀或體征或 疑似相關病原體感染的病例，其中肺炎克雷伯桿菌，對照方 法檢測陽性病例233例，對照方法檢測陰性病例1315例，試

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驗體外診斷試劑與測序法對比，陽性一致率99.57% ( 95%CI:97.63%~99.99% ) ， 陰 性 符 合 率 99.39% (95%CI:98.81%~99.74%);肺炎鏈球菌，對照方法檢測陽 性病例262例，對照方法檢測陰性病例1280例，試驗體外診 斷試劑與測序法對比，陽性一致率100.00%(95% CI: 98.60%~100.00%)，陰性符合率99.53%(95% CI: 98.99%~99.83%);流感嗜血桿菌，對照方法檢測陽性病例 206例，對照方法檢測陰性病例1342例，試驗體外診斷試劑 與測序法對比，陽性一致率99.51%(95% CI:97.33%~99.99%)， 陰性符合率99.33%(95% CI:98.73%~99.69%);銅綠假單 胞菌，對照方法檢測陽性病例163例，對照方法檢測陰性病 例1385例，試驗體外診斷試劑與測序法對比，陽性一致率 100.00%(95% CI:97.76%~100.00%)，陰性符合率99.64% (95% CI:99.16%~99.88%);金黃色葡萄球菌，對照方法 檢測陽性病例172例，對照方法檢測陰性病例1376例，試驗 體外診斷試劑與測序法對比，陽性一致率99.42%(95% CI: 96.80%~99.99%)，陰性符合率99.64%(95% CI: 99.15%~99.88%);嗜肺軍團菌，對照方法檢測陽性病例5例， 對照方法檢測陰性病例1543例，試驗體外診斷試劑與測序法 對比，陽性一致率100.00%(95% CI:47.82%~100.00%)， 陰性符合率99.87%(95% CI:99.53%~99.98%)。

  第二部分，為進一步驗證試驗用體外診斷試劑臨床性能，

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采用試驗用體外診斷試劑與已上市同類產(chǎn)品進行比對，已上 市同類產(chǎn)品選擇博奧晶芯生物科技有限公司生產(chǎn)的呼吸道 病原菌核酸檢測試劑盒(恒溫擴增芯片法)，上海之江生物 科技股份有限公司生產(chǎn)的嗜肺軍團菌核酸檢測試劑盒(熒光 PCR法)。共計入組499例具有下呼吸道癥狀或體征或疑似相 關病原體感染的病例，其中肺炎克雷伯桿菌，對已上市同類 產(chǎn)品檢測陽性病例78例，已上市同類產(chǎn)品檢測陰性病例421 例，試驗體外診斷試劑與已上市同類產(chǎn)品對比，陽性一致率 100%(95% CI:95.38%%~100%)，陰性符合率99.29%(95% CI:97.93%~99.85%);肺炎鏈球菌，已上市同類產(chǎn)品檢測 陽性病例79例，已上市同類產(chǎn)品檢測陰性病例420例，試驗 體外診斷試劑與測序法對比，陽性一致率100%(95% CI: 95.44%~100%)，陰性符合率98.81%(95% CI: 97.24%~99.61%);流感嗜血桿菌，已上市同類產(chǎn)品檢測陽 性病例86例，已上市同類產(chǎn)品檢測陰性病例413例，試驗體 外診斷試劑與測序法對比，陽性一致率100%(95% CI: 95.80%~100%)，陰性符合率99.27%(95% CI: 97.89%~99.85%);銅綠假單胞菌，已上市同類產(chǎn)品檢測陽 性病例78例，已上市同類產(chǎn)品檢測陰性病例421例，試驗體 外診斷試劑與測序法對比，陽性一致率100.00%(95% CI: 95.38%~100.00%)，陰性符合率98.81%(95% CI: 97.25%~99.61%);金黃色葡萄球菌，已上市同類產(chǎn)品檢測

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陽性病例72例，已上市同類產(chǎn)品檢測陰性病例427例，試驗 體外診斷試劑與測序法對比，陽性一致率100%(95% CI: 95.01%~100%)，陰性符合率99.30%(95% CI:97.96%~99.85%);嗜肺軍團菌，已上市同類產(chǎn)品檢測陽性 病例60例，已上市同類產(chǎn)品檢測陰性病例439例，試驗體外 診斷試劑與測序法對比，陽性一致率100.00%(95% CI:94.04%~100.00%)，陰性符合率100%(95% CI: 99.16%~100%)。

  第三部分，臨床試驗統(tǒng)計了部分入組病例的病原體分離
培養(yǎng)信息，對試驗體外診斷試劑檢測結果與病原體分離培養(yǎng)
結果進行了比對分析，結果顯一致性良好。

  綜上所述，該產(chǎn)品臨床試驗試劑符合《體外診斷試劑臨
床試驗技術指導原則》的相關要求。臨床試驗結果顯示該產(chǎn)
品與病原體核酸測序、已上市同類產(chǎn)品及病原體分離培養(yǎng)結
果一致性較好。

四、產(chǎn)品收益風險判定

  根據(jù)申請人提供的申報資料，經(jīng)綜合評價，在目前認知
水平上，認為該產(chǎn)品的上市為適用人群帶來的受益大于風險。
但為保證用械安全，基于對主要剩余風險的規(guī)避，需要在說
明書中提示以下信息:

1.本試劑盒體外定性檢測人痰液中臨床常見下呼吸道病 原菌，包括肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、莢膜型流感嗜血

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桿菌、銅綠假單胞菌、嗜肺軍團菌和金黃色葡萄球菌。檢測 結果可用于呼吸道疑似細菌感染的住院病人或重癥病人的 輔助診斷，檢測結果不直接用于指導抗生素的使用。臨床診 斷應結合病原體培養(yǎng)鑒定。本試劑盒檢測結果僅供臨床參考， 不得作為臨床診斷的唯一標準。建議結合患者臨床表現(xiàn)和其 他實驗室檢測對病情進行綜合分析。

2.警示及注意事項:產(chǎn)品說明書中介紹了該產(chǎn)品檢驗方 法的局限性及使用中的注意事項。

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綜合評價意見

本申報項目為境內(nèi)第三類醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊，屬于境內(nèi) 同品種首個產(chǎn)品。申請人的注冊申報資料符合現(xiàn)行要求，依 據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》(國務院令第739號)、《體 外診斷試劑注冊管理辦法》(原國家食品藥品監(jiān)督管理總局 令 2014 年第 5 號)等相關醫(yī)療器械法規(guī)與配套規(guī)章，經(jīng) 系統(tǒng)評價后，建議準予注冊。

附件:產(chǎn)品說明書

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2022 年 4 月 28 日

六項呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒(多重熒光 PCR 法)說明書

通用名稱:六項呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒(多重熒光 PCR 法) 【包裝規(guī)格】24 人份/盒
【預期用途】

本試劑盒體外定性檢測人痰液中臨床常見下呼吸道病原菌，包括肺炎克雷伯桿菌、肺炎 鏈球菌、莢膜型流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、嗜肺軍團菌和金黃色葡萄球菌。

檢測結果可用于呼吸道疑似細菌感染的住院病人或重癥病人的輔助診斷，檢測結果不直 接用于指導抗生素的使用。臨床診斷應結合病原體培養(yǎng)鑒定。

呼吸道感染分為上呼吸道感染與下呼吸道感染，其中下呼吸道感染是患者門診就診最常 見的病因，大部分的下呼吸道感染是由細菌感染導致，細菌感染或繼發(fā)感染經(jīng)常引起呼吸道 疾病癥狀的加重，如不能及時準確地明確病原體種類，并針對性用藥，將會延誤疾病的最佳 治療時間，然而目前傳統(tǒng)的診療手段主要為生化指標的鑒定、病原體培養(yǎng)等，方法操作準確 性不夠、周期長，很難給醫(yī)生提供精準的輔助診斷，進而使得大部分的用藥仍處于經(jīng)驗性用 藥階段，不僅加快了細菌產(chǎn)生耐藥的周期，也影響了患者的及時診斷。

【產(chǎn)品名稱】

本試劑盒檢測結果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標準。建議結合患者臨床表 現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。
【檢驗原理】

本試劑盒是基于 Taq 酶水解熒光探針產(chǎn)生熒光信號及帶熒光產(chǎn)物雜交產(chǎn)生熒光信號的兩 種技術原理，針對單色熒光通道中一個目標靶點的檢測采用熒光探針，另一個目標靶點的檢 測采用熔解曲線的方式，從而實現(xiàn)在單色熒光通道中同時進行兩個目標靶點的檢測和分析。 試劑盒針對待檢測細菌核酸保守區(qū)設計的特異性引物、特異熒光探針，配以 PCR 反應液等組 分，在熒光定量 PCR 儀上，應用多重實時熒光定量 PCR 檢測技術，通過熒光信號的變化實 現(xiàn)對待測樣本中下呼吸道病原菌核酸的快速檢測。

PCR 檢測體系含有陽性內(nèi)對照(內(nèi)標)，通過檢測待測樣本中編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)管家基因的 DNA 是否正常，進而來監(jiān)測待測樣本的提取過程和 PCR 擴增過程，避 免假陰性結果。
【主要組成成分】

本試劑盒由以下組分組成:

備注:
1.推薦使用本公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(湘長械備 20150021 號)進行核酸提取。 2.不同批號產(chǎn)品的成分之間不可以混用或互換。
3.試劑盒內(nèi)的生物樣本均已經(jīng)滅活處理。
4.自備試驗器材:無 DNA 酶、RNA 酶的 1.5 mL 離心管、0.2 mL PCR 反應管、吸嘴(建議使

用帶濾芯吸嘴，規(guī)格:10μL、200μL、1000μL);離心機;振蕩混合器;(磁珠)分離器;

各種規(guī)格的加樣槍。

【儲存條件及有效期】

1.試劑盒置于-20±5°C保存，有效期為 12 個月。 2.試劑應避光密閉，生產(chǎn)日期，失效日期請見外包裝盒。不使用時，這些試劑在包裝標識的效 期內(nèi)可穩(wěn)定存放。一旦使用，反復凍融應不超過 3 次，每周開封 1 次，可連續(xù)檢測 3 次。 【適用儀器】

適用于宏石 SLAN-96P 全自動醫(yī)用 PCR 分析系統(tǒng)、Life Technologies QuantStudio TM 5 熒光 PCR 儀。
【樣本要求】
1.適用樣本類型:痰液。

2.樣本采集:用無菌容器采集患者的痰液，痰液經(jīng)生理鹽水或 4%NaOH 液化后樣本量應不少 于 1mL。

3.樣本保存和運送:待測樣本可在 2°C~8°C放置 72 小時，在≤-20°C條件下可放置 3 年，避 免反復凍融。

【檢驗方法】
一、試劑準備(在試劑準備區(qū)進行) (一)取出包裝盒中的各組分，室溫放置，待其溫度平衡至室溫后，震蕩混勻，瞬時離心后 備用;
(二)根據(jù)待測樣本、陽性對照、陰性對照的數(shù)量，按比例(下呼六-PCR 反應液 44μL/人份+

下呼六-酶混合液 1μL/人份)取相應量的下呼六-PCR 反應液和下呼六-酶混合液，充分混 勻成 PCR 混合液，2000rpm 離心 10s 后備用。

二、樣本處理與加樣(在樣本處理區(qū)進行)(下呼六-陰性對照、下呼六-陽性對照與待測樣本 同步處理)

(一)樣本前處理
往樣本收集管中加入等體積生理鹽水或 4%NaOH，充分液化，然后把全部液體倒入 1.5mL 離

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心管中，作為待測樣本備用。
(二)樣本處理
取 200μL 待測樣本、下呼六-陽性對照、下呼六-陰性對照到 1.5mL 離心管，使用圣湘生物科技 股份有限公司的核酸提取或純化試劑(湘長械備 20150021 號)按其說明書操作進行核酸提取。 (三)加樣
1.吸取上述處理好的樣本、下呼六-陽性對照及下呼六-陰性對照各 5μL 分別加入對應的 0.2mL

PCR 反應管中，每管加入 45μL PCR 混合液，蓋上管蓋; 2.建議采用如表 1 所示的布板方式點樣上機檢測。

表 1 建議的點樣布板示意圖(96 孔板)

三、PCR 擴增(請參照各儀器使用說明書進行設置)
(一)將 PCR 反應管放入擴增儀樣品槽，按對應順序設置陽性對照、陰性對照及待測樣本， 并設置樣本名稱。
(二)熒光檢測通道選擇:
1.選擇 FAM 通道檢測肺炎克雷伯桿菌和嗜肺軍團菌;2)選擇 HEX 通道檢測肺炎鏈球菌和內(nèi) 標;3)選擇 ROX 通道檢測流感嗜血桿菌;4)選擇 CY5 通道檢測銅綠假單胞菌和金黃色葡 萄球菌。
(三)循環(huán)參數(shù)設定:

注:在宏石熒光 PCR 儀上熔解曲線溫度為 62-75°C，在 Quant Studio 5 熒光 PCR 儀上由于 軟件無法改動溫度，應用默認的 60-90°C。
四、結果分析(請參照宏石 SLAN-96P 儀器使用說明書進行設置) (一)目標靶點檢測信號為 FAM，HEX(或 VIC)，ROX，以及 CY5 通道，內(nèi)標檢測信號為 HEX 通道的熔解曲線;

(二)Baseline 的設置:Baseline 一般設置為 3-15 個循環(huán)，具體可根據(jù)實際情況進行調(diào)整。其 調(diào)整原則為:選擇指數(shù)擴增前熒光信號較穩(wěn)定的區(qū)域，起點(Start)避開熒光采集起始階段的 信號波動，終點(End)比最早出現(xiàn)指數(shù)擴增的樣本 Ct 減少 1-2 個循環(huán)。Threshold 的設置: 設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品的最高點。 (三)結果陰陽性判定:先分析內(nèi)標在 HEX 通道是否檢測到熔解曲線特征峰，且 Tm 在65.8~68.5°C之間，若有，表示本次檢測有效，可繼續(xù)進行后續(xù)分析:

1.若 FAM 通道檢測到典型的 S 型擴增曲線，且 Ct≤39，表示肺炎克雷伯桿菌檢測結果為陽性， 若 Ct>39 或無 Ct，則為陰性;若 FAM 通道檢測到 Tm(68.8~71.3°C)特征峰，表示嗜肺軍 團菌檢測結果為陽性，若無熔解曲線特征峰或 Tm 不在 68.8~71.3°C之間，則為陰性;
2.若 HEX 通道檢測到典型的 S 型擴增曲線，且 Ct≤39，表示肺炎鏈球菌檢測結果為陽性，若 Ct>39 或無 Ct，則為陰性;

3.若 ROX 通道檢測到典型的 S 型擴增曲線，且 Ct≤39，表示流感嗜血桿菌檢測結果為陽性， 若 Ct>39 或無 Ct，則為陰性;

D) 若 CY5 通道檢測到典型的 S 型擴增曲線，且 Ct≤39，表示銅綠假單胞菌檢測結果為 陽性，若 Ct>39 或無 Ct，則為陰性;若 CY5 通道檢測到 Tm(66.8~70.0°C)特征峰，表示金 黃色葡萄球菌檢測結果為陽性，若無熔解曲線特征峰或 Tm 不在 66.8~70.0°C之間，則為陰性; 4.若內(nèi)標在 HEX 通道沒有檢測到 Tm(65.8~68.5°C)特征峰，表示本次檢測樣本濃度太低或 者有干擾物質(zhì)抑制反應，需重新準備實驗。

表 2 陰陽性判定方法

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/ / / 擴增曲線Ct≤39 銅綠假單胞菌陽性

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五、質(zhì)量控制

熔解曲線特征峰 金黃色葡萄球菌陽 66.8~70.0°C 性

(一)下呼六-陰性對照:檢測靶標均為陰性，即 FAM、HEX、ROX、CY5 通道中應無熔解 曲線，以及無擴增曲線(No Ct)或 Ct 值>39;
(二)下呼六-陽性對照:陽性對照應檢測 FAM、HEX、ROX、CY5 通道均有明顯 S 型擴增 曲線，且檢測 Ct 值≤33;且在三個通道中均有熔解曲線特征峰，Tm 分別為 FAM(68.8~71.3°C)， HEX(65.8~68.5°C)，CY5(66.8~70.0°C)。 (三)以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。 【陽性判斷值】

根據(jù)臨床研究實驗數(shù)據(jù)繪制 ROC 曲線，通過參考值的研究，確定本試劑盒用擴增曲線檢 測目標基因的 Ct 陽性判斷值為 39，用熔解曲線來檢測目標基因的 Tm 陽性判斷值為 FAM(68.8~71.3°C)，HEX(65.8~68.5°C)，CY5(66.8~70.0°C)。
【檢驗結果的解釋】

對于陽性樣本及細菌培養(yǎng)物，內(nèi)標檢測結果不作要求;對于陰性樣本(六種呼吸道病原 菌均未檢出)，其內(nèi)標檢測應為陽性，若其內(nèi)標檢測為陰性，則該樣本的檢測結果無效，應 查找并排除原因，并對此樣本重新采樣，進行重復實驗(若重復試驗的檢測結果仍無效，請 與本公司聯(lián)系)。

【檢驗方法的局限性】

樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送及保存質(zhì)量有關，其中任何失誤都將會導致結果 不準確。如果樣本處理時沒有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性結果。本試劑盒檢測是針對 病原菌的保守區(qū)，極少發(fā)生突變，但不排除病原體在流行過程中的基因突變可能導致假陰性

結果。本試劑盒僅用于痰液提取的核酸檢測，檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結 合其病史、癥狀以及其他實驗室檢查等情況綜合考慮。

本試劑盒檢測對象僅包括呼吸道肺炎克雷伯桿菌，肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，銅綠假 單胞菌，嗜肺軍團菌，金黃色葡萄球菌等，并未涵蓋與呼吸道感染相關的全部細菌，因此， 報告的呼吸道病原菌種僅限于本試劑盒所檢測的菌種，檢測結果陰性不代表樣本未含有其他 病原體。

陰陽性符合率:本試劑盒檢測企業(yè)參考品，陰、陽性符合率均為 100%。

精密性:精密度度試驗表明批間、日間、不同操作者間及不同房間檢測重復性好，同一 份樣本平行檢測結果 Ct 值的變異系數(shù)(CV，%)應≤5%，熔解曲線檢測結果應一致，均為陽

性。特異性:本試劑盒涵蓋的各呼吸道病原菌之間無交叉反應;與常見呼吸道病原體(溶血 葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、嗜麥芽窄食單胞菌、 糞腸球菌、白色念珠菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、化膿鏈球菌、滕黃微球菌、馬紅球菌、格氏李斯特 菌、瓊氏不動桿菌、副流感嗜血桿菌、杜莫夫軍團菌、產(chǎn)氣腸桿菌、溶血嗜血桿菌、嗜麥芽 糖寡癢單胞菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、唾液鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、結核分枝桿菌、甲 型流感病毒、乙型流感病毒、黃曲霉菌、土曲霉菌、煙曲霉菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌陽 性樣本)無交叉反應。

【產(chǎn)品性能指標】

最低檢測限:本試劑盒對各病原菌企業(yè)參考品最低檢測限分別為肺炎克雷伯菌 900 CFU/mL、肺炎鏈球菌 15 CFU/mL、流感嗜血桿菌 625 CFU/mL、銅綠假單胞菌 675 CFU/mL、 嗜肺軍團菌 340 CFU/mL、金黃色葡萄球菌 2875 CFU/mL。

抗干擾能力:干擾物質(zhì)參考品檢測表明，常見的治療呼吸道感染的藥物(如美羅培南、 亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、莫西沙星、阿米卡星、利奈唑胺、萬古霉素等)在正常的使用 劑量濃度下對本試劑無干擾。

臨床性能:兩次臨床研究共檢測樣本 2047 例，首次臨床 1548 例，總體樣本陽性一致性 百分比為 99.88%(95% CI:99.31%~100.00%)，陰性一致性百分比為 97.72%(95% CI: 96.37%~98.66%)，總一致性百分比為 98.84%(95% CI:98.17%~99.31%);同時每種病原體 進行了待考評試劑與病原體分離培養(yǎng)鑒定方法的比較研究，靈敏度為 100.00%(95% CI: 99.32%~100.00%)，特異度為 72.22%(95% CI:69.35%~74.97%)，總符合率為 81.91%(95% CI:79.90%~83.80%);增補臨床試驗 499 例，總體樣本:陽性一致性百分比為 100%(95% CI: 99.09%~100%)，陰性一致性百分比為 79.79%(95% CI:70.25%~87.37%)，總一致性百分比 為 96.19%(95% CI:94.12%~97.69%)。通過此次臨床研究表明:圣湘公司開發(fā)的六項呼吸道 病原菌核酸檢測試劑盒(多重 PCR 熒光法)與金標準核酸序列測定對照方法檢測結果具有很 好的一致性，與已上市同類產(chǎn)品對照試劑檢測結果具有很好的一致性，與病原體分離培養(yǎng)鑒 定符合率高，并且操作簡單，符合臨床檢測要求，具有較高的臨床應用價值。

【注意事項】

1. 本品僅用于體外檢測，使用前請仔細閱讀本說明書。
2. 試驗前請熟悉和掌握需使用的各種儀器的操作方法和注意事項，對每次實驗進行質(zhì)量控制。 3. 實驗室管理應嚴格按照 PCR 基因擴增實驗室的管理規(guī)范，實驗人員必須進行專業(yè)培訓，實

驗過程嚴格分區(qū)進行，所用消耗品應潔凈，且一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用

的儀器和設備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用。
4. 操作待檢樣本時應注意防護，實驗過程中穿工作服，戴一次性口罩及手套并經(jīng)常替換手套

以避免樣品間的交叉污染;樣本操作、廢棄物處理均需符合相關法規(guī)要求:衛(wèi)生部《微生 — 19 —

物生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》和《醫(yī)療廢物管理條例》。
5. 所有的試劑在使用前，均需在室溫下充分融化、混勻后使用。
6. 試劑盒采用泡沫箱加蓄冷劑的方式運輸 5 天，溫度不高于 20°C不會影響產(chǎn)品效期。 【參考文獻】
[1] 李金明. 實時熒光 PCR 技術[M]. 北京:人民軍醫(yī)出版社, 2007:63-65.
[2] Huang Q, Liu Z, Liao Y, et al. Multiplex Fluorescence Melting Curve Analysis for Mutation Detection with Dual-Labeled, Self-Quenched Probes. PLoS ONE (2011), 6(4): e19206.
[3] Tenover FC. Developing molecular amplification methods for rapid diagnosis of respiratory tract infections caused by bacterial pathogens.Clin Infect Dis 2011; 52 (suppl 4): S338–45. 【基本信息】
注冊人/生產(chǎn)企業(yè)名稱:圣湘生物科技股份有限公司
住所:長沙高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)麓松路 680 號
聯(lián)系方式: 傳真號碼:
售后服務單位名稱:
聯(lián)系方式: 傳真號碼:
生產(chǎn)地址:長沙高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)麓松路 680 號
生產(chǎn)許可證編號:
【醫(yī)療器械注冊證編號/產(chǎn)品技術要求編號】
【說明書核準日期及修改日期】